Setelah menjalani pembedahan pintas arteri koronari di Amerika Syarikat pada tahun 2000, pihak-pihak yang terdekat dengan Sultan Iskandar melaporkan bahawa gaya hidup baginda semakin perlahan sehingga baginda sekali-sekala keluar berangkat bermain golf.[9] Pada bulan Januari 2010, baginda pernah dimasukkan ke dalam hospital tempatan untuk merawat penyakit bronkitis.[113]

Sultan Iskandar mangkat pada 22 Januari 2010, pada jam 7:15 malam di Hospital Pakar Puteri, Johor Bahru setelah dimasukkan pada awal hari itu kerana gering pada usia 77.[114]Kemangkatan baginda diumumkan secara rasmi pada 11:20 malam oleh Menteri Besar Johor, Datuk Abdul Ghani Othman mengumumkan bahawa bendera negeri Johor diturunkan separuh tiang mula jam 6:00 pagi hingga jam 6:00 petang. Almarhum akan disemayamkan di Istana Besar, Johor Bahru dan dimakamkan di Makam Diraja Bukit Mahmoodiah pada jam 2:00 petang keesokannya, sebaik sahaja tamatnya waktu orang ramai menziarahi persemayaman Almarhum Sultan Iskandar pada waktu pagi.[115]